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固相萃取—液相色譜法測定大豆油中維生素K1含量
維生素K為人體必需的脂溶性維生素，其中人體維生素K1主要來源于綠葉蔬菜（如菠菜、甘藍、萵苣等）、大豆及其制品。隨著對維生素K生理功能研究的不斷深入，發現其具有促進凝血、參與骨骼代謝、維持心血管健康等諸多功能。
近年來，國內外研究人員對食物中維生素K1分析測定日益關注。在食品中維生素K1檢測方法中，液相色譜法（HPLC）因具有靈敏、精密度高、分離效果好、樣品處理簡單、分析速度快等優點而受到廣泛應用。我國已制定蔬菜和乳制品中維生素K1含量的測定方法，但由于缺乏良好的提取和分析方法，國內尚無測定大豆油中維生素K1的標準方法，有關大豆及大豆制品中維生素K1的研究報道也較少。近年來，在色譜分析樣品前處理中，固相萃取（Solid Phase Extraction， SPE）成為重要的方法之一，越來越多的國內研究者使用SPE進行色譜分析食品樣品的前處理。測定大豆油中維生素K1含量的關鍵是如何進行分離提取，去除各種干擾物質并避免維生素K1破壞。本研究選用SPE硅膠柱對樣品進行凈化處理，分離提取大豆油中的維生素K1，運用靈敏、的液相色譜法測定樣品中維生素K1。
1 材料與方法
1.1 儀器及試劑
UV1201紫外-可見檢測器、AS1201自動進樣器、RO1201溶劑管理器、P1201高壓恒流泵、EC2006色譜數據處理系統（大連依利特公司）；Laborota 4001旋轉蒸發儀；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵；Eppendorf AG5305隔膜真空泵；SC-2546型低速離心機；G-560E漩渦振蕩器；SPE硅膠柱（6 mL，1 g）。
正己烷（色譜純）、甲醇（色譜純）、維生素K1標準品（純度>99%）購自美國Sigma公司；yi醚（分析純）、正己烷（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司。
1.2 測定方法
1.2.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μL）；柱溫：30 ℃；流動相：V（甲醇）︰V（正己烷）=98︰2；檢測波長：248 nm；進樣量：20 μL；流速：1.5 mL/min。
1.2.2 標準溶液的制備 稱取維生素K1標準品0.1 g（至0.001 g），用正己烷溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中搖勻，得1 mg/mL維生素K1標準儲備液。
1.2.3 樣品提取與凈化 所有操作在避光室內微弱黃光燈下進行。
取0.1 g油樣（至0.001 g）溶于5 mL正己烷，劇烈震蕩5 min，離心5 min（3 000 r/min），取4.5 mL上清液，待凈化。
將SPE硅膠柱（6 mL，1 g，Agilent）分別用8 mL正己烷︰yi醚=97︰3和8 mL正己烷將SPE柱活化后，提取液以1.0 mL/min流速過柱；用8 mL正己烷以1.0 mL/min流速淋洗小柱，后分5次加入20 mL正己烷︰yi醚=97︰3溶液洗脫，收集洗脫液后濃縮吹干；用5 mL正己烷溶解殘渣，轉移至試管低溫濃縮30 min，加1 mL正己烷定容離心5 min，經0.45 μm濾膜過濾后上機分析。
1.2.4 測定方法 吸取上述樣品溶液與標準品溶液分別注入液相色譜儀，測得色譜峰面積，以外標法計算樣品中的維生素K1含量。
2 結果與分析
2.1 樣品預處理方法優化
脂溶性維生素K1在大豆油中含量豐富，如何避免維生素K1破壞并去除干擾物質是分離提取的關鍵。GB 5413.10-2010將嬰幼兒乳制品中的脂肪酶解皂化后提取維生素K1，但維生素K1遇堿易分解，皂化處理使測定結果降低。趙丹霞等采用溶劑萃取提取植物油中的維生素K1，方法簡單，但是樣品不經凈化或凈化不*，共同洗脫下的干擾物質如維生素A、維生素D、維生素E會影響HPLC的分離效果。固相萃取法比溶劑萃取法使用的溶劑更少，操作過程也相對簡單，提取和凈化同步完成。GB/T5009.158-2003測定蔬菜中維生素K1選用氧化鋁做色譜柱，避免使用氧化鋁可能造成的維生素K1分解現象。對樣品進行凈化處理前要先用失活的磷酸鹽處理氧化鋁，前處理時間長且處理過程復雜。Kamao等使用SPE硅膠柱凈化處理油脂類食品，再進行HPLC分析，SPE硅膠柱體積小，對樣品的富集和凈化效果好。因此，對方法進行改進后采用硅膠柱固相萃取法凈化大豆油樣品，標準品和樣品提取與凈化后的HPLC分析圖譜分別見圖1和圖2。
由圖1和圖2可以看出，處理后的樣品分析圖譜基線穩定，保留時間附近的雜質被有效去除，干擾較少。同時，對維生素K1標準品進行回收試驗驗證，結果顯示回收率較高，詳見表1。
2.2 樣本量大小確定及加樣回收率試驗
本研究采用SPE硅膠柱（6 mL，1 g，Agilent）柱內硅膠填料容量較小。由于大豆油取樣量過大，在載樣過程中可能有部分維生素K1不能被吸附，直接影響層析效果，造成回收率偏低。參考上樣體積對維生素K1回收的影響，通過比較不同的上樣體積，終確定SPE硅膠柱的佳上樣質量為0.1 g。此時分離效果較好，樣品中維生素K1的回收率也較好，結果可靠（詳見表2）。
2.3 標準曲線制備
吸取維生素K1標準儲備液100 μL，用分析純正己烷溶解定容至5 mL，混勻，得到濃度為20 μg/mL的稀釋液。再分取一定體積用正己烷稀釋溶解定容，分別配制成含維生素K1 0.125，0.25，0.50，2.50，5.00，
10.00 μg/mL的標準液，上機測定，以維生素K1標準品濃度為橫坐標、以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖3。結果表明，維生素K1在0～10 μg/mL范圍內線性關系良好（R2>0.999）。
2.4 低檢測限
將標準工作液依次稀釋，以10倍儀器響應值標準偏差與標準曲線斜率的比值計算得到儀器的檢測限為0.062 5 μg/mL。
2.5 重復性測定
在較短的間隔時間內，取同一份維生素K1標準樣品進行6次測定，結果見表3。此次試驗的變異系數為3%，由此可見試驗重復性較好。
2.6 溶液穩定性測定
取同一個待測樣品分別放置在避光和室內室溫暗處（22～25 ℃）0，2，4，6，8 h，取待測樣品溶液20 μL在同一色譜條件下進行測定，結果見表4。結果顯示，測定樣品中維生素K1含量的穩定性較好。
2.7 大豆油樣品中維生素K1含量測定
測定29種大豆油中的生素K1平均含量，結果顯示未檢出至215 μg/100 g，平均140.92±33.99 μg/100 g。由于地理環境、植物種類存在差異，因此需要對測定結果做進一步研究。未檢出的樣品中可能不含維生素K1或含量較低，未達到本方法的低檢出限。
3 結論與討論
本方法建立了固相萃取-液相色譜法測定大豆油中維生素K1的方法，改變了樣品的前處理方法，避免使用皂化處理，減少了維生素K1的損失。利用固相萃取方法凈化處理樣品，能有效地去除樣品中的干擾物質。采用富集和凈化效果好的小體積硅膠柱，所獲結果可靠、重復性良好，適用于測定不同種類的大豆油中維生素K1的含量。
